Linfocitos TCD4 señuelo como tratamiento a la infección por VIH (página 2)

El objetivo de la
terapia antirretroviral durante la infección aguda por
HIV-1 es reducir el número de células
infectadas, preservar la respuesta inmune específica para
HIV-1 y de ser posible, reducir el punto de
equilibrio viral a largo plazo. En diversos estudios
recientes se ha mostrado que el tratamiento de la
infección aguda por HIV-1 permite la supresión
viral a largo plazo, conlleva a la preservación y al
incremento de las respuestas de células T de ayuda
específicas para HIV-1 y permite la conservación de
una población viral muy homogénea.

Los primeros estudios piloto en pacientes que recibieron
tratamiento durante la infección aguda por HIV-1 y que
posteriormente se sometieron a interrupciones estructuradas del
tratamiento, muestran que la respuesta inmune contra HIV-1
podría estimularse [Rosenberg 2000]. La mayoría de
los pacientes pudieron suspender la terapia posteriormente y
presentaron al menos un control temporal
de la replicación viral, con puntos de equilibrio
viral que en algunos pacientes se mantuvieron por debajo de 5,000
copias/ml durante más de 3 años.

Sin embargo, en la mayoría de los individuos en este
estudio [Kaufmann 2004], así como en otros

estudios que evaluaron el control viral después del
tratamiento de la infección primaria [Markowitz 1999],
hubo rebote de la carga viral durante el seguimiento a largo
plazo, lo que requirió del inicio de la terapia.

Revisión de agentes
antirretrovirales

En la actualidad se encuentran disponibles cuatro clases de
agentes antirretrovirales para el tratamiento de la
infección por HIV: análogos de nucleósidos y
nucleótidos (NRTIs), inhibidores de la transcriptasa
inversa no análogos de nucleósidos (NNRTIs),
inhibidores de proteasa (PIs) e inhibidores de fusión,
con T-20 como

prototipo. Más de 20 fármacos han sido aprobados
para utilizarse, incluso fórmulas de agentes
antirretrovirales, tanto individuales como combinados .

Una serie de otros fármacos y de nuevas clases de
éstos están casi terminados y se espera que se
aprueben en unos cuantos años. La
investigación también se enfoca en estrategias
inmunomoduladoras, con vacunas o
citocinas (interferones, interleucinas).

Tabla 2.1: Agentes antirretrovirales (1)

Inhibidores de la Transcriptasa Inversa Análogos de
Nucleósidos y

Nucleótidos (NRTIs)

Nombre comercial
                
Abreviación               
Fármaco        
Fabricante

Combivir.
                                
    CBV            
           
AZT+3TC        
      GSK

Emtriva.                                  
    
FTC                       
Emtricitabina        Gilead

Epivir.
                                    
 3TC
3TC,                    
lamivudina       
      GSK

Hivid.                                      
ddC
ddC,                    
zalcitabina      
    Roche

Retrovir.
                                 
 AZT
AZT,                    
zidovudina       
      GSK

Trizivir.                                    
    
TZV                        
AZT+3TC+ABC       GSK

Truvada.                                  
FTC+TDF                                           
     Gilead

Videx.
                                    
   ddI
ddI,                     
didanosina      
      BMS

Viread.
                                   
      TDF                      
Tenofovir         
     Gilead

Zerit.
                                      
d4T D4T,
                    
 estavudina      
     BMS

Ziagen.
                                   
    ABC
                      
 Abacavir         
     GSK

Inhibidores de la Transcriptasa Inversa no
Análogos de Nucleósidos

(NNRTIs)

Rescriptor.                              
   
DLV                        
Delavirdina      
    Pfizer

Sustiva.
                                  
    EFV                        
Efavirenz         
     BMS

Viramune.
                              
    NVP
                     
 Nevirapina        
Boehringer Ingelheim

Inhibidores de la Proteasa (PIs)

Agenerase.                              
  
APV             
          
 Amprenavir      
      GSK

Crixivan.                                  
   
IDV                         
Indinavir          
      MSD

Fortovase.
                              
SQV-FTV
                   
 Saquinavir             
Roche

Invirase.                                  
SQV-INV
                   
 Saquinavir       
     Roche

Inhibidores de Fusión

Fuzeon.                                  
T-20
                          
 Enfuvirtide       
     Roche

(1)

Perspectivas en el
tratamiento

Los medicamentos que actúan en la fusión de
VIH con la
membrana celular constituirían otro de los hitos en la
obtención de productos
medicamentosos para seres humanos. Los investigadores
descubrieron fortuitamente que los péptidos que
correspondían a las secuencias breves de gp41
inhibían la penetración de VIH en las
células (Jiang y col. 1993; Wild y col. 1994)

Los péptidos en cuestión rompen la interacción de las secuencias n36 y c34 de
la glucoproteina gp41. Uno de los peptidops de 36 aminoacidos
conocido como T20 se liga al surco hidrófobo de la espiral
enrollada N36 que bloquea eficazmente la penetración de
VIH-1 en la celulas que este invade de preferencia.

La resistencia a T20
surgio por mutaciones en gp41 (Rimsky y col. 1998).

Células Señuelo:

Este nombre lo utilizó inicialmente, desde los
cincuenta, un histotecnólogo que trabajaba con el Profesor
Leopold Koss: Andrew Ricci, quien llamaba así a
células con cambios nucleares reactivos que hacían
confundir con células malignas (de allí
"células trampa"). En la primera edición
del libro de
citopatología del Dr. Koss, en 1968, antes de clasificarse
el virus, ya
él postulaba que muchas de estas alteraciones
podrían deberse a una infección viral (Koss
LG. Diagnostic Cytology and its Histopathologic
Bases. 2º ed. Philadelphia, JB Lippincott, 1968).
Actualmente la denominación "decoy cells" se utiliza
exclusivamente para designar a las células con inclusiones
características del PV en la orina.

Células señuelo como tratamiento:

Un equipo de científicos aragoneses dirigidos por el
Dr. Alejandro Tres trabaja desde enero de 2007 en un proyecto que
consiste en atacar al enemigo desde dentro, y que ellos mismos
han dado en definir como un "Caballo de Troya" para el cáncer.
Estas células son cargadas magnéticamente y se
espera sean atraídas por el tumor para luego por medio de
resonancia generar calor dentro
de ellas y destruir las células neoplásicas.

Antecedentes de su uso en tratamiento para el VIH:

No fue posible encontrar referencias a investigaciones
con el mismo blanco de tratamiento ni utilizando células
humanas modificadas para inhibir la reproducción vírica.

MARCO DE
REFERENCIA

1.- Manual de avances
en el tratamiento VIH :

Gustavo Reyes-Terán

HIV Medicine, 2006 – EurasiaHealth, 831 pp;

PLANTEAMIENTO DEL
PROBLEMA

¿Puede el uso de linfocitos T CD4 señuelos ser
el tratamiento resolutivo para infección por VIH y sus
manifestaciones clínicas?

JUSTIFICACIÓN.

El VIH y su manifestación clínica el SIDA ha sido
considerada la enfermedad del siglo por su alta incidencia y
mortalidad. Cerca de 40 millones de personas se encontraban
infectadas al final del año 2004 y se espera que para el
año 2020 la cifra aumete a 70 millones (2)

Aunque existen más de dos docenas de productos
diferentes actualmente, disponibles para el tratamiento de la
infección por HIV, hay una creciente necesidad de
fármacos nuevos. Esto es cierto no sólo para los
pacientes con virus multirresistentes que están esperando
nuevas opciones de tratamiento.

Se anticipan problemas
significativos, relacionados con una toxicidad a largo plazo y
con la adherencia, con las terapias que posiblemente
necesistarán prolongarse durante décadas enteras,
puesto que la erradicación del HIV no es posible en la
actualidad.

Como resultado, hay una necesidad urgente de fármacos
nuevos que sean más fáciles de tomar, que tengan
elevadas barreras genéticas contra el desarrollo de
resistencia y sobre todo, que sean menos tóxicos. Los
fármacos nuevos deben ser más potentes que
aquéllos disponibles hoy en día, para poder alcanzar
finalmente la meta de la
erradicación.

Este estudio supone la creación de un tratamiento de
bajo costo y
fácil fabricación, con pocos o sin efectos
secundarios que mejorara la calidad de
vida de cerca de 40 millones de personas y que
supondrá un ahorro para
estas de casi 20 mil millones de dólares al año
(3).

OBJETIVO

1.- Determinar la doxiciclina ejerce una inhibición en
la síntesis
de proteínas
sobre linfocitos T CD4 humanos.

2.- Determinar si el efecto de inhibición de la
síntesis de proteínas de la doxiciclina sobre
Linfocitos T CD4 es permanente o transitorio.

3.- Conocer el efecto de la doxiciclina sobre los receptores y
sobre la membrana de Linfocitos T.

2.- Determinar si el uso de Linfocitos T CD4 señuelo
puede resolver la infección por VIH en humanos.

HIPÓTESIS.

Los linfocitos T señuelo serán linfocitos
estructuralmente igual al de cualquier linfocito no infectado en
un paciente con VIH pero sin la capacidad de sintetizar cualquier
proteína lo que evitara que estas células puedan
participar en la replicación de los virones.

Los virones serán incapaces de diferenciar aquellos
linfocitos sin capacidad replicativa de aquellos que si la poseen
y fundirán sus membranas indiscriminadamente, la carga
genetica de aquellos virones que entren en contacto con
linfocitos T señuelo quedara inutilizable dentro del
linfocito T señuelo.

Los linfocitos T señuelo serán capaces de
recibir tantos virones de VIH como cualquier otro linfocito sano,
habrá mas cantidad de linfocitos T señuelo en el
plasma del paciente por lo que las probabilidades de que el viron
quede inutilizado será mayor de que encuentre a un
linfocito con capacidad replicativa, lo que reducirá la
carga viral y a la larga la eliminará.

La doxiciclina es un medicamento antimicrobiano que
actúa inhibiendo la transpeptidacion en las células
bacterianas, el efecto adverso mas común en grandes dosis
es su acción
de inhibición de transpeptidacion sobre las células
humanas.

En este estudio se pretende utilizar el efecto secundario de
la doxiciclina en grandes dosis para inhibir de forma permanente
la transpetidacion en linfocitos t in vitro.

DISEÑO

10. 1. Se estudiaran 75 cultivos de linfocitos T CD4 humanos
obtenidos mediante citometria de flujo y cultivados en medio
Eagle

           
Se hará un estudio comparativo con cultivos controles sin
doxiciclina ni carga viral.

10.2. El estudio será abierto en esta fase de la
investigación.

a)       10.3. El investigador
tendra una influencia experimental en esta fase.

10.4. Tiempo en que
suceden los eventos.

Prospectivo. los datos obtenidos
serán de eventos que se presenten en el futuro

10.5. Relación que guardan entre sí los
datos.

b) Longitudinal. los datos se obtienen del mismo sujeto en
más de una ocasión y se relacionan entre si

MATERIALES Y
MéTODO

11.1. Las muestras de linfocitos T CD 4
serán obtenidas de individuos sanos.

Las muestras virales se obtendran de pacientes VIH (Virus de
la inmunodeficiencia humana) positivos y con diagnostico de
SIDA
(Síndrome de inmunodeficiencia adquirida) causada por este
virus.

11.4. Definición de variables

11.5. Descripción de procedimientos.

SEPARACIÓN DE
LINFOCITOS T

1.1)    Separación de
mononucleares en sangre.

MATERIALES

-Tubos de plástico
de centrífuga de 15 ml.

-Pipetas Pasteur de distintos tamaños.

-Centrífuga

-Pipetas automáticas de distintos tamaños.

-Cámara de Neubauer.

-Cubreobjetos.

-Microscópio óptico.

-Ficoll-Histopaquededensidad 1.078.

-Ficoll-Histopaque de densidad
1.119.

-Tampón fosfato PBS.

PROCEDIMIENTO

En un tubo cónico de centrífuga, de 15
mililitros, se depositan los dos gradientes de Ficoll-Histopaque
de densidades diferentes, una que se coloca primero de densidad
1.119 y otra que se coloca lentamente sobre la anterior, de
densidad 1.078.

Sobre estos dos colchones de Ficoll-Histopaque de 3 ml de
volumen cada
uno, se añaden muy suavemente otros 5 ml de sangre diluida
1:1 en PBS, que ha sido obtenida estérilmente por
 venopunción en tubos que contienen heparina litio
como anticoagulante. La sangre diluida se deja resbalar por las
paredes del tubo para que se deposite sobre el gradiente de
Ficoll de densidad 1.078.

Los tubos se centrifugan a 2.500 rpm durante 30 minutos a
temperatura
ambiente. Tras
la centrifugación se observan dos halos opacos en la
interfase: el superior correspondiente a las células
mononucleares y el inferior a las polinucleares. Ambos halos se
recogen por separado y se lavan las células tres veces con
PBS.

Los botones celulares resultantes se resuspenden en 1 ml o
más de PBS cada uno, según el tamaño del
botón, se cogen 50 microlitros de cada muestra, con
pipeta de precisión tipo Hamilton, y se extiende en
cámaras de Neubauer separadas para su contaje en
microscópio.

La cámara de Neubauer consiste en una placa gruesa de
cristal en forma de porta, cuya porción central
está dividida en tres bandas perpendiculares al eje
longitudinal de la cámara. De ellas, las dos laterales se
hallan sobreelevadas 01 mm con respecto a la central, y en esta
última hay grabado un retículo cuadrangular. La
banda central puede estar, a su vez, subdividida en dos
semibandas idénticas y separadas por un surco paralelo al
eje longitudinal de la banda. En cada una de estas dos semibandas
hay grabado un retículo idéntico.

1.2) Separación de linfocitos T de linfocitos
B

UNI-SORB (Referencia U-01) 

Columna en lana de nilón lista para su uso, para la
preparación de fracciones enriquecidas en linfocitos T y
linfocitos B a partir de preparación de linfocitos
totales.

PROCEDIMIENTO DE SEPARACIÓN

1. Quitar el tapón protector del grifo.

2. Sujetar la columna volcada y abrir el grifo. Levantar la
tira de la cápsula metálica en la parte superior de
la columna.

3. Inyectar lentamente a través del tapón de
caucho rosa
(debajo de la cápsula metálica), la cantidad
suficiente de una solución al 5% de Suero Bovino Fetal en
el PBS para cubrir enteramente la malla de nilón 1 x 10
ml. Volcar la columna para permitir al medio de cultivo en exceso
fluirse y a las burbujas de aire
evacuarse.

4. Preparar los linfocitos para la centrifugación por
gradiente de densidad (referencia UNI-SEP con LYMPHOPREP)

5. Obtener una suspensión de 108 células en 2 ml
de solución de Suero Bovino Fetal en el PBS.

6. Volcar la columna e inyectar lentamente la
suspensión de células a través del
tapón rosa, grifo abierto.

7. Cerrar el grifo y dejar incubar la columna durante 60
minutos a temperatura ambiente.

8. Quitar el tapón de aluminio y el
tapón de caucho de la parte superior.

9. Abrir el grifo y colectar el eluyente. Lavar la malla de
nilón con medio de cultivo (2 x 10 ml) para quitar
totalmente las células no adherentes.

10. Para recoger las células B, llenar la columna con
medio de cultivo (10 ml) y comprime la malla con el pistón
(recomendamos el pistón de una jeringuilla de uso
único de 5 ml de 13 mm de diámetro)

11. Centrifuga las células colectadas y retirar el
sobrenadante. Resuspender el culote de células con 10 ml
de medio de cultivo adecuado.

Obtención
de los cultivos

Añada un Diagrama de
flujo. Describa el desarrollo de la investigación y
todos los procedimientos con que obtendrá sus datos,
quién y cómo los realizará. Ejem:
cuestionarios, técnicas
quirúrgicas y/o de laboratorio,
análisis de expedientes, etc., de tal forma
que cualquier investigador pudiera realizar la
investigación

11.6. Hoja de captura de datos.

Diseñe una hoja de vaciado de datos donde se registren
todas las variables
y  parámetros de medición.

11.7. Calendario.

1.- Revisión bibliográfica indique el tiempo que
invertirá mes(es)

2.- Elaboración del protocolo:
indique el tiempo que invertirá mes(es)

3.- Obtención de la información. indique el tiempo que
invertirá mes(es)

4.- Procesamiento y análisis de los datos. indique el
tiempo que invertirá mes(es)

S.- Elaboración del informe
técnico final. indique el tiempo que invertirá
mes(es)

6.- Divulgación de los resultados. indique el tiempo
que invertirá mes(es)

Fecha de inicio: indique la fecha de inicio considerando desde
la investigación bibliográfica. Fecha de
terminación: indique la fecha de terminación
(agregue los meses de cada actividad a la fecha de inicio)

11.8. Recursos.

1 1.8. 1. Recursos
Humanos.

Investigador: Nombre del investigador principal

Actividad actividad asignada 

Número de horas por semana número de horas por
semana que dedicará a la investigación.

Investigador: Nombre del investigador responsable

Actividad actividad asignada 

Número de horas por semana número de horas por
semana que dedicará a la investigación.

Investigador: Nombre del investigador(es) asociado(s)

Actividad actividad asignada  

Número de horas por semana número de horas por
semana que dedicará(n) a la investigación.

11.8.2. Recursos materiales.

Los recursos que se requiere adquirir son:

Liste el material que se requerirá en la
investigación.

Detalle descripción, costo y proveedor

1.8.3. Recursos financieros.

(Atención, si contempla financiamiento
de la industria
farmacéutica, es obligatorio hacer una cita en la Dirección de Investigación para la
realización del convenio correspondiente)

Desglose la cantidad erogada para cada uno de los siguientes
rubros:

*Sueldo a mayo 2004

(1) Número de horas a la semana que dedica
al protocolo

(2) Número de semanas que durará el
protocolo

Los recursos se obtendrán de:

Indique la fuente de obtención y monto de los recursos
económicos

VALIDACIÓN  DE
DATOS

 (Seleccione las
opciones)

I) Se utilizará estadística
descriptiva: medidas de tendencia central y
dispersión: rango, media, mediana, moda,
desviación estándar, proporciones o
porcentajes.

II) Por tener dos o más muestras, se utilizará
estadística inferencial.

Pare el (los) parámetro(s) principal(es): Indique el
parámetro que considerará para llegar a la
conclusión

a) escala nominal.
Prueba de Chi cuadrada

b) escala ordinal. Prueba de Chi cuadrada

c) escala de intervalo: Prueba de homogeneidad de Varianza; si
ésta demuestra homogeneidad, entonces T de Student  o
Análisis de Varianza; si no hay homogeneidad de varianza
se usará estadística no paramétrica. El
nivel de significancia para rechazar la hipótesis nula (Ho) será de
p<0.05.

III) Por involucrar pruebas
diagnósticas, se determinará: sensibilidad,
especificidad, valor
predictivo positivo y negativo.

IV) Por medir asociación, se utilizará:
Análisis de Correlación lineal, Coeficiente de
correlación de Spearman, otras.

V)  Para casos y controles: se medirá fuerza de
asociación, razón de Momios y Chi-cuadrada de
Mantel-Haenszel.

VI) Otra(s) prueba(s) estadística(s)

PRESENTACIÓN DE
RESULTADOS

Se usarán tablas y/o gráficas (pastel, barras, histogramas,
líneas, puntos).

CONSIDERACIONES éTICAS.

"Todos los procedimientos estarán de acuerdo con lo
estipulado en el Reglamento de la ley General de
Salud en Materia de
Investigación para la Salud.

Seleccione de los siguientes enunciados el que mejor se ajuste
a su estudio, una vez confirmado por su asesor borre los
demás y este párrafo:

Título segundo, capítulo I, Artículo 17,
Sección I, investigación sin riesgo, no
requiere consentimiento informado.

Título segundo, capítulo I, Artículo 17,
Sección II, investigación con riesgo mínimo,
se anexa hoja de consentimiento informado

Título segundo, capítulo I, Artículo 17,
Sección III, investigación con riesgo mayor al
mínimo, se anexa hoja de consentimiento informado.

Título Segundo, Capítulo II. De la
investigación en comunidades

Artículos 28-33

Título Segundo, Capítulo III De la
investigación en menores de edad o incapaces,
Artículos 34-39

Título segundo, Capítulo IV De la
investigación en mujeres en edad fértil,
embarazadas, durante el trabajo de
parto,
puerperio, lactancia, recién nacidos; de la
utilización de embriones, óbitos y fetos y
de la fertilización asistida, Artículos 40-56

Título segundo, Capítulo V De la
investigación en grupos
subordinados. Artículo 57. Estudiantes,
trabajadores de laboratorios y hospitales, empleados y otros.
Artículo 58. Cuando se realice en estos grupos, en la
Comisión de ética
deberá participar un o más representantes de la
población en estudio capaz de representar los valores
morales, culturales y sociales y vigilar:

I.                    
que la negación a participar no afecte su situación
escolar, o laboral.

II.                  
Que los resultados no sean utilizados en perjuicio de los
participantes

III.                 
Que la institución o patrocinadores se responsabilicen del
tratamiento y en su caso de indemnización por las
consecuencias de la investigación.

Título segundo, Capítulo VI De la
investigación en órganos, tejidos y sus
derivados, productos y cadáveres de seres humanos
artículos 59 (obtención, conservación,
utilización preparación suministro y destino
final.) y 60 (además del debido respeto al
cadáver humano, la observación del título decimocuarto
en cuanto a la materia de control sanitario de la
disposición de órganos, tejidos y cadáveres
de seres humanos.)

Titulo tercero. De la investigación de nuevos
recursos profilácticos, de diagnóstico,
terapéuticos y de rehabilitación.
Capítulo I Artículos 61-64

Cuando se realice investigación en seres humanos sobre
nuevos (o se modifiquen) recursos profilácticos, dx,
terapéuticos o rehabilitación, además
deberán solicitar autorización de la
Secretaría presentando documentación requerida (ver Ley)

Titulo tercero Capítulo II De la investigación
farmacológica, Artículos 65-71

Título séptimo. De la investigación que
incluya la utilización de animales de
experimentación. Capítulo único.
Artículos 121-126

REFERENCIAS
BIBLIOGRÁFICAS

Goodman y Gilman, Las bases Farmacológicas de la
terapeutica, 10° Ed. 2004, 1367: 1390

(1) Christian Hoffmann, Jürgen Rockstroh, and Bernd
Sebastian Kamps (Editors)

Flying Publisher
2006
825 pp

(2) 2006 AIDS epidemic update : December 2006 (UNAIDS/WHO,
November 2006)

Autor:

Rafael Antonio Calderón Cortés

Facultad de Medicina
Unidad Torreón de la Universidad
Autónoma de Coahuila

México

Enero – Marzo de 2006